前言：雙抗夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是zui典型的免疫分析法，被廣泛用于檢驗醫(yī)學(xué)工作中疾病診斷、食品安全、環(huán)境分析等領(lǐng)域。
抗原抗體結(jié)合的特異性，酶催化反應(yīng)的專一性，生物素和親和素級聯(lián)放大效應(yīng)都極大地提高了雙抗夾心法ELISA檢測的靈敏度，對檢測物的快速診斷提供了重要保證。然而，ELISA從標(biāo)本制備到結(jié)果檢測的任何一個步驟都影響了zui終結(jié)果的判讀。今天上海恒遠(yuǎn)分享一篇影響雙抗夾心法ELISA實驗結(jié)果的七大因素分析，希望能幫助到您！
1、樣本和檢抗的加樣方式：
雙抗夾心法ELISA常規(guī)檢測方法是樣品、抗體試劑單獨加入。但有些試劑盒推薦樣品和檢測抗體一起加來縮減步驟從而加快檢測的時間。然而由于游離的樣品和檢測抗體先結(jié)合后形成空間位阻效應(yīng)，可能會影響樣品和包被抗體的結(jié)合。所以，一般不建議將ELISA步驟中樣品和檢測抗體一同孵育。
2、孵育溫度：
孵育溫度可以選擇25℃，這樣可以降低檢測的背景而又可以保持其在37℃下的檢測靈敏度。然而在OD值整體偏低的情況，就不建議這么做了。
3、封閉與否：
牛血清白蛋白在ELISA反應(yīng)中可以防止酶的分解和非特異性吸附。但是封閉并不是對所有的ELISA體系都必須。有實驗表明，牛血清白蛋白封閉并不能提高ELISA體系的檢測靈敏度，反而影響了低濃度樣品的檢測。原因可能是高濃度下的牛血清白蛋白可能會影響低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/樣本與抗體結(jié)合，導(dǎo)致檢測的靈敏度降低。因此，只要抗體的活性高，也可以不用封閉這一常用的步驟。
4、洗液中吐溫濃度：
吐溫20是陰離子表面活性劑，防止了抗原抗體的非特異性結(jié)合同時也防止后面的抗體或樣品吸附到微孔板上，因此ELISA包被抗體時一定不能含有吐溫20，但是包被以后的步驟中的緩沖液都可以含有吐溫20，其濃度在0.05%為*。
5、樣本嚴(yán)重溶血：
樣本嚴(yán)重溶血紅細(xì)胞破壞溶解時，釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定試驗中，容易在溫育過程中吸附于微孔板，從而與加入的底物反應(yīng)顯色，干擾測定結(jié)果，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
6、樣本污染：
樣本的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，使檢測結(jié)果出現(xiàn)非特異性顯色。因此，ELISA檢測應(yīng)采集新鮮樣本。
影響ELISA的因素還有很多，例如，酶標(biāo)板的選擇，包被緩沖液的種類，包被抗體的pH避免與包被緩沖液的pH相同等小細(xì)節(jié)。
7、邊緣效應(yīng)：
邊緣效應(yīng)是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時盡量采用水浴。
看完以上內(nèi)容，您是否覺得科研之路深似海？上海恒遠(yuǎn)提醒：ELISA測定的應(yīng)用非常廣泛，雖然其操作步驟簡單，但影響ELISA檢測的因素也非常多，分布在ELISA反應(yīng)全過程的每一個環(huán)節(jié)，科研人員要根據(jù)實驗樣品和抗體建立一個標(biāo)準(zhǔn)的操作流程，才能得到穩(wěn)定的實驗結(jié)果。如果您在實驗中遇到任何不明白的問題，都可本公司，我們將為您免費安排技術(shù)指導(dǎo)服務(wù)哦！
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