恒遠(yuǎn)：膜蛋白研究的整體解決方案

提起膜蛋白，浮現(xiàn)在廣大從事蛋白研究的科研工作者腦海中的是兩點(diǎn)：1.膜蛋白功能的重要性。2.膜蛋白研究的困難性。

*，膜蛋白在細(xì)胞間接觸、表面識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和運(yùn)輸方面都扮演著重要的角色。由于它們功能多樣，也就成為理想的藥物靶點(diǎn)。然而，膜蛋白的生化和結(jié)構(gòu)研究一直都很緩慢。Protein Database的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在成功解析出三維結(jié)構(gòu)的蛋白中，膜蛋白只占1%，這與膜蛋白占總蛋白的1/3的總量的差別巨大。由此也可以看出膜蛋白研究確實(shí)困難重重。

 

圖 1. 利用QIAgenes優(yōu)化序列，昆蟲細(xì)胞體外進(jìn)行膜蛋白表達(dá)。 利用 EasyXpress Insect Kit II，crude lysates （T）， supernatant （S）， and pellet fraction （P） by SDS-PAGE and western blotting using Penta·His antibodies. Note that microsomes with integrated membrane proteins are visualized in the pellet fraction （P） after centrifugation of the reaction.

由于膜蛋白的過表達(dá)可能對(duì)細(xì)胞有毒性，并且在純化時(shí)很難選擇合適的溶解試劑，再加上目前對(duì)膜蛋白晶體培養(yǎng)缺少有效方法和模型，所以要想順利地獲得膜蛋白的三維數(shù)據(jù)更是難上加難。幸虧技術(shù)總在進(jìn)步，創(chuàng)新的產(chǎn)品也不斷涌現(xiàn)。QIAGEN在2009年推出了膜蛋白的整體解決方案：QIAgenes Expression Kit-解決膜蛋白表達(dá)難題；Ni-NTA membrane Kit-率純化重組膜蛋白；NeXtal Cubic Phase Kit-輕松獲得膜蛋白晶體不再是夢(mèng)想。

QIAgenes Expression Kit預(yù)制蛋白表達(dá)載體，可以幫你克服蛋白（包括膜蛋白）表達(dá)的難題。該預(yù)制表達(dá)載體采用的GeneOptimizer軟件，對(duì)DNA序列進(jìn)行以下方面的優(yōu)化：稀有密碼子，GC含量，ARG位點(diǎn)，可變剪切點(diǎn)，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素進(jìn)行優(yōu)化，確保優(yōu)化后的序列能在E.coli的體內(nèi)，體外，真核細(xì)胞的體內(nèi)或體外，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。

成功表達(dá)了膜蛋白，接下來的挑戰(zhàn)就是怎么分離出表達(dá)的膜蛋白。與可溶性蛋白不同，膜蛋白具有單重或多重跨膜結(jié)構(gòu)容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致膜蛋白很難溶解。目前常用的方法就是去污劑進(jìn)行膜蛋白的溶解。去污劑同時(shí)具有疏水和親水區(qū)域，和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污劑的復(fù)合物，從而可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化。但是這里必須要指出的是，由于膜蛋白的種類不同，適合其溶解的去污劑類型也不一樣，這就需要在溶解膜蛋白是篩選一系列的去污劑以獲得*的溶解效果。為了從事膜蛋白研究工作者的寶貴時(shí)間，QIAGEN推出了Ni-NTA Membrane Protein Kit，專門用于帶有His標(biāo)簽的重組膜蛋白的溶解和后續(xù)純化。

Ni-NTA Membrane Protein Kit有兩部分組成，一部分是膜蛋白的溶解試劑，該部分包括7種zui常用的去污劑，用于供客戶篩選自己的去污劑；另一部分是Ni-NTA純化試劑，用于在膜蛋白溶解用，利用His標(biāo)簽和Ni-NTA的親和特性進(jìn)行進(jìn)一步純化。該試劑盒zui大的優(yōu)勢(shì)在于幫助膜蛋白研究者在zui短的時(shí)間篩選得到*的去污劑，并且進(jìn)行Ni-NTA純化獲得純度高的膜蛋白。


圖 2. 利用QIAGEN Ni-NTA membrane Kit篩選NhaA 的去污劑類型。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OG和NG不適合該膜蛋白的溶解，可以選擇DM， LDA0， DDM Cy6， 和FOS 進(jìn)行NhaA溶解. M： His-tagged marker proteins。


圖 3.  選擇DDM進(jìn)行NhaA的溶解，然后利用Ni-NTA進(jìn)行純化。
TP: total protein; SF: soluble fraction; FT: flow-through fraction; W: wash fraction; E: eluate; M: markers.

在成功的純化得到膜蛋白后，如果想獲得膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)，又要面臨一個(gè)難題。據(jù)Protein DataBase 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在成功解析出結(jié)構(gòu)的蛋白中，膜蛋白只占了1%左右的比重。由此也可以看出，膜蛋白缺乏缺乏有效的結(jié)晶方法。目前常用脂立方相法建立膜蛋白的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。但是該方法存在以下局限性：1.步驟超多，建立實(shí)驗(yàn)過程非常復(fù)雜2.容易造成結(jié)晶孔間的交叉污染3.不適合高通量實(shí)驗(yàn)4.浪費(fèi)膜蛋白。為了使膜蛋白的結(jié)晶成功率提高，QIAGEN開發(fā)出了NeXtal® CubicPhase Kit。

 

 

NeXtal® CubicPhase Kit之所以能夠提高膜蛋白結(jié)晶的成功率，主要原因：1.采用NeXtal CubicPhase μplate，這種結(jié)晶板修飾了monoolein （MO，用于建立脂立方相），另外這種結(jié)晶板具有非常好的光學(xué)特性，在可見光下就可以觀測(cè)到膜蛋白晶體。2.采用專門的膜蛋白結(jié)晶溶液，QIAGEN專門開發(fā)出CubicPhase I＆II Suite用于膜蛋白結(jié)晶。 NeXtal® CubicPhase Kit非常適合高通量膜蛋白結(jié)晶。


圖4. NeXtal CubicPhase μplate結(jié)晶板，結(jié)晶孔修飾DMO。
 

圖5.利用eXtal CubicPhase Cystallization System成功進(jìn)行了bacterio-rhodopsin （BR） 結(jié)晶。